盡管單次使用已非全新的理念，并且在囊式過濾器和貯存袋之類的產(chǎn)品中已經(jīng)成為標準操作，當下單次使用工藝比常規(guī)的生產(chǎn)方法更為復雜，由集成模塊構(gòu)成——尤其是在新設備中——通常替代了原來的不銹鋼設備。 

目前單次使用技術被*是可以減少交叉污染的風險，降低投資風險，具備更大的靈活性，可以為試驗用藥品提供具有成本效益的產(chǎn)品開發(fā)方案。單次使用生物反應器問世尚未超過20 年，考慮到諸如此類的因素，可以認為這種技術在如此短的時間之內(nèi)呈現(xiàn)出迅猛發(fā)展，推陳出新的發(fā)展態(tài)勢。 

當前，得益于單克隆抗體（mAb）生產(chǎn)領域中菌株的優(yōu)化和培養(yǎng)基的改善，分批補料式哺乳動物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的生產(chǎn)效率已經(jīng)顯著提升。生物量濃度已經(jīng)從1-3 g/L 增至7-10 g/L，因此促進了較小規(guī)模的生產(chǎn)容器的運用，不過與此同時，也讓下游的工藝面臨更多的難題。[1,2] 產(chǎn)量更大、濃度更高，深層過濾器難以進行處理。對大于500 L 的體積，要降低生產(chǎn)成本并減少浪費，離心機的使用*。 

運用即用型澄清系統(tǒng)，高達2,000L 的體積都可實現(xiàn)單次使用處理，這樣商業(yè)可行的方案，在一個步驟內(nèi)就能替代離心機和深層過濾器。

收集技術 

高產(chǎn)品滴度源自于細胞密度的增加而非每一種細胞單位生產(chǎn)率的提升，所以固體量會明顯增大，常規(guī)的收集技術難以應對。 

目前，zui廣泛應用的單次使用收集技術是深層過濾。不過，生物量濃度較高的情況下，深層過濾器在負載量較低時就會堵塞。較高的污染物濃度也讓深層過濾器對批次變異更為敏感，因此為了彌補過濾能力的波動， 過濾器的面積會過大（ 多達50%）。目前可以使用離心之類的單次使用細胞去除方案，但是生產(chǎn)能力較低，導致成本較高，浪費較大。 

不過，一種新替代方案已經(jīng)出現(xiàn)。賽多利斯斯泰迪生物技術公司的產(chǎn)品Sartoclear Dynamics 是一種新的單次使用技術，用于高細胞密度的動物細胞培養(yǎng)的收集。這種即用型的澄清系統(tǒng)得益于血漿成分分離行業(yè)的啟發(fā)，以摻漿過濾（BFF）的理念作為基礎，該系統(tǒng)性能穩(wěn)定、易于使用、快速、可以靈活地放大。 

該系統(tǒng)可以處理高達2,000 L 的體積，因此能夠在一個步驟之內(nèi)同時替代離心機和深層過濾器。關鍵因素在于進料流中添加了高孔隙度的助濾劑，增加了濾餅的滲透性，防止過濾器出現(xiàn)堵塞。

摻漿過濾 

很長時間以來， 摻漿過濾中運用硅藻土（DE）之類的助濾劑來提升過濾器的性能。[3] 硅藻土（DE， 或稱為diatomite 、kieselgur/kieselguhr） 是一種天然存在的硅質(zhì)沉積巖，質(zhì)軟，通常粒徑為10-200 μm。DE 是由硅藻（微小的單細胞藻類）化石的殼或外骨骼構(gòu)成，具有高孔隙率的結(jié)構(gòu)和惰性特征，通常在生物技術行業(yè)的收集階段用于深層過濾器。加入到細胞培養(yǎng)基中的DE 具有雙重作用：濾除亞微米的顆粒，并形成一個具有滲透性的濾餅，改善過濾器的處理量。這種細小的助濾劑顆粒形成無數(shù)微小通道，懸浮的雜質(zhì)被截留，而澄清的液體可以不受阻礙地通過。 

BFF 的工作原理 

現(xiàn)在有眾多產(chǎn)品的生產(chǎn)運用了BFF 系統(tǒng)，其中包括靜脈注射免疫球蛋白（IVIG）、白蛋白和一些凝血因子，所基于的原理包括選擇性pH 誘導沉淀、離子強度、添加乙醇以及溫度的變化。[4-6] 沉淀物的去除采用的是DE 強化的深層過濾。 

實際操作過程中，需要進行澄清操作的生物工藝流體中固體的濃度過高時，流體將不能透過過濾器表面的濾餅（圖1）。添加DE 之類的助濾劑之后，形成的濾餅更具滲透性，可以防止堵塞。所需DE 的量取決于顆粒的濃度。為了獲得理想的結(jié)果并使用盡可能少的DE，建議對細胞培養(yǎng)液進行預處理?？梢蕴砑幽蹌┗蛘呖梢越档蚿H 值，從而形成聚集體，其體積大至不能進入濾餅層。這樣，濾餅可以保持滲透性，而DE 與生物量的比例可以降低為1:4。

 
賽多利斯斯泰迪生物技術公司的產(chǎn)品Sartoclear Dynamics 是一種新的單次使用技術，用于高細胞密度的哺乳動物細胞的收集，該技術得益于血漿成分分離行業(yè)的啟發(fā)，以摻漿過濾（BFF）的理念作為基礎。（圖片有賽多利斯公司提供）圖1：加入硅藻土（左）的動態(tài)摻漿過濾和常規(guī)的過濾（右）。

DE 有各種級別，純度和滲透性各異，適合不同的應用，而賽多利斯斯泰迪生物技術公司選擇了Celpure C300 作為哺乳動物細胞培養(yǎng)操作中zui合適的助濾劑。 

Celpure C300 特別針對制藥領域設計，采用生產(chǎn)工藝制造，是一種高純度的DE，具有更出色的操作穩(wěn)定性。在多種培養(yǎng)基、介質(zhì)和活力條件下進行的測試發(fā)現(xiàn)，的DE 濃度為細胞濕重（WCW）的40-50%，如果pH 降低至5，這一比例還可以減小至20-30%。 

低pH 值沉淀的優(yōu)勢 

對于微孔過濾和深層過濾之類的細胞去除技術，性能的差異可以歸結(jié)于低pH 值水平（pH 4.3-5.5）下較小顆粒的沉降。[4-5] 細胞碎片、DNA 以及宿主細胞蛋白在酸性條件下的溶解性都會降低。6 另外，降低pH 值之后可以形成較大的顆粒，原來在pH 7.0 時存在的亞微顆粒會*消失（圖2）。與此類似，較低的pH 值也有利于BFF 的操作：所測試的細胞培養(yǎng)上清液在酸性條件下時，濾出液比中性條件時更為澄清（未顯示數(shù)據(jù)）。

 
圖2：三種不同的收集方式（綠色=pH 7.0，紅色=pH 5.0，）下，不含細胞的中國倉鼠卵巢（CHO）細胞培養(yǎng)上清液的平均粒徑分布。利用Mastersizer 2000（Malvern Instruments 公司）記錄數(shù)據(jù)。

人們認為，DE 可以捕獲大顆粒（>0.4μm），因此總體的滲透性和過濾能力會降低。通過增加DE 的濃度，有可能改善其性能，截留小顆粒，同時不會喪失所需的濾餅滲透性。另外，雖然大部分抗體在酸性條件下是穩(wěn)定的，但是有一些抗體可能會出現(xiàn)共沉淀。[5-6] 實驗室的BFF 測試在低pH 值條件時，可以獲得85% 以上的回收率（未顯示數(shù)據(jù)）。 

實際應用 

細胞培養(yǎng)收集過程中BFF 已經(jīng)作為一種替代方法得到廣泛應用，因此賽多利斯斯泰迪生物技術公司與RentschlerBiotechnologie 公司合作，評估這種技術作為單次使用技術，替代離心機和深層過濾器的可能性。[7] 測試中采用了600 L 的細胞培養(yǎng)生產(chǎn)過程，對條件進行了優(yōu)化，評估了BFF 技術的升級放大。 

Sartoclear Dynamics 是專門針對藥品生產(chǎn)過程中哺乳動物細胞培養(yǎng)的澄清操作而設計的產(chǎn)品，利用這種設備在一系列細胞株和培養(yǎng)介質(zhì)中獲得了測試結(jié)果。 

運用高細胞密度的中國倉鼠卵巢（CHO） 細胞分批補料式培養(yǎng)（17.6×106 cells/mL，95% 的活力，1000L），進行了試驗生產(chǎn)測試。[8] zui大的BFF 測試為600 L，pH 5.0（WCW = 8%）。在放大試驗中，在通用型不銹鋼支架中使用了總過濾面積為1.61 m2的七個工藝放大模塊。 

過濾器的過濾盒由兩層聚乙烯過濾板組成，中間為DE 和生物量。600L的收集液中加入Cellpure C300 DE（12kg），預填充DE 袋通過無塵適配器與混合袋連接，迅速安全地轉(zhuǎn)移DE。溫和混勻5 分鐘之后，DE 的粉末溶于細胞懸浮液中；另外，在過濾前，對所獲得的混合物調(diào)節(jié)pH 至5.0，以140 rpm 的速度混合2 小時。 

圖3 所示為操作過程中的壓力增加情況。當壓力值達到1.3 bar 時，過濾過程結(jié)束，初始收集液已經(jīng)過濾。在整個過程中保持了大約為300 L/m2/h 的快速且穩(wěn)定的流速，并且總體的處理能力達到了311L/m2。在過濾過程中，澄清的收集液流具有很低的濁度水平（5–8 NTU）。中和之后，zui終的液體具有41 NTU 的濁度，這個數(shù)值相當高，可能的原因在于未能充分調(diào)節(jié)中和緩沖液的用量。 

在一項小規(guī)模的平行測試中，改良中和步驟之后可以防止?jié)岫鹊脑黾?。正在開發(fā)的一種即用型整合工藝模塊，可以讓pH 值的在線調(diào)節(jié)實現(xiàn)可控。例如，IgG1 的回收率目前為85%（圖3），今后，通過優(yōu)化中和步驟，改進過濾后沖洗，mAb 的回收率將有望進一步得到提升。在整個工藝過程內(nèi)對宿主細胞蛋白質(zhì)和DNA 之類的污染物進行了監(jiān)控，在zui終的液體內(nèi)（緩沖液沖洗以及中和之后），這些污染物的濃度分別從841 和13.8 mg/ml 降低至629 和5.0 mg/ml。

 
圖3：七個過濾器模塊中，降低pH（5.0）的情況下DE 摻漿過濾試驗放大的結(jié)果。左：過濾性能、壓力（bar）、流量（L/m2）以及過濾過程中的濁度。右：IgG1 的回收，在初始收集液、無緩沖沖洗的收集液（液1）、有緩沖沖洗（液2）以及中和之后的收集液（液3）中進行測量。

實驗結(jié)果 

BFF 的試運行試驗證實了此前實驗室中觀察到的結(jié)果：DE 加入到初始的細胞培養(yǎng)上清液之后，將pH 降低至5.0，這樣的條件之下在過濾性能、沖洗和污染物去除方面可以獲得的結(jié)果。此外，只需運用七個過濾模塊，就可以在1 小時之內(nèi)對600L 的收集液進行處理。因為模塊座可以容納多達33 個的模塊，可以預計，高達3,000L 的收集體積可以同時進行過濾。因此，運用這樣的方法，在單次使用的大規(guī)模裝置內(nèi)，可以對初始的高密度細胞培養(yǎng)收集液實現(xiàn)的澄清操作。 

總結(jié) 

測試的目的是為了證實一種新穎的單次使用收集方法，對于高密度的哺乳動物細胞培養(yǎng)具有普遍的適用性，測試中采用了不同的細胞株和培養(yǎng)條件下的初始收集液，確定了DE 作為助濾劑的濃度。此外，在低pH 條件下，發(fā)現(xiàn)助濾劑的量可以減少50%。 

與沉淀過程結(jié)合使用時，研究中的單次使用澄清系統(tǒng)穩(wěn)定可靠，無需再使用離心機，其結(jié)果穩(wěn)定一致，該系統(tǒng)易于操作、快速、可以在線放大，可以將兩步驟的細胞收集操作轉(zhuǎn)變?yōu)榈膯尾襟E操作，節(jié)約了時間和資金。 

BFF 等類似可以實現(xiàn)放大的技術彌補了單次使用產(chǎn)品市場中zui大的空白之一。當前單次使用生物反應器的標準體積設定為2000 L，如此龐大的體積，不再需要離心機來去除細胞，這對于生物制藥行業(yè)而言是巨大的技術進步，構(gòu)建了一個真正的單次使用過程，帶來了的靈活性，顯著地降低了資金投入。Sartoclear Dynamics 這種產(chǎn)品特別針對cGMP 工藝設計，由單次使用預填充袋組成，其中含有超純級別的硅藻土，可以在0.5-10 kg 的范圍內(nèi)選擇。無塵粉末轉(zhuǎn)移裝置配備有快速連接適配器，DE可以直接與細胞培養(yǎng)液混合。這種多孔的助濾劑可以防止過濾器堵塞，另外因為該系統(tǒng)內(nèi)生物量和助濾劑一直保持穩(wěn)定的比例，過濾器的性能則可以連續(xù)穩(wěn)定且達到狀態(tài)，用戶因此受益。BFF能夠以高流速對非常稠密的初始細胞收集液進行澄清操作，因此具有經(jīng)濟效益并且提升了生產(chǎn)力。(end)北京富瑞恒創(chuàng)科技有限公司。